灣區時訊 近日，中國科學院南海海洋研究所張長生研究員團隊和廈門大學王斌舉教授團隊合作在P450酶催化糖肽分子內苯酚偶聯反應的機制研究方面取得新進展，相關成果“Discovery and Biosynthesis of Cihanmycins Reveal Cytochrome P450-Catalyzed Intramolecular C−O Phenol Coupling Reactions”發表于Journal of the American Chemical Society（《美國化學會志》）。南海海洋所博士方春艷、副研究員張麗萍和廈門大學博士汪永超生為論文共同第一作者，南海海洋所研究員張長生、研究員朱義廣和廈門大學教授王斌舉為共同通訊作者。

在化學生物學領域，細胞色素P450酶因其獨特、多樣的催化能力而備受矚目。P450酶催化的分子內C−O和C−C苯酚偶聯反應在天然產物生物合成中扮演著關鍵角色，廣泛存在于糖肽類抗生素如萬古霉素和**拉寧中。雖然糖肽類抗生素中多個催化分子內苯酚偶聯反應P450酶的功能和晶體結構相繼被解析，但底物復合物結構的缺失導致該類反應的催化機制一直是未解之謎。

研究團隊從放線菌Amycolatopsis cihanbeyliensis DSM 45679中發現了C−O連接的新型雙環糖肽類化合物cihanmycins（CHMs, 圖1）。CHM A (1)的結構通過X-ray單晶衍射確定為雙環糖肽，包含肉桂?；鶊F和兩個稀有的d-阿拉伯呋喃糖。研究團隊基于生物信息學分析和異源表達實驗，在DSM 45679的基因組中定位了CHM的基因簇，并通過體內基因敲除和體外生化實驗證實了3個P450酶的功能：Cih26負責肉桂?；鶊F的環氧化和羥化，Cih32負責三個氨基酸的羥化，Cih33及其同源蛋白DmlH和EpcH催化分子內C−O苯酚偶聯反應形成CHM的雙環骨架（圖1）。

圖1. CHM生物合成中3個P450酶的功能

為揭示Cih33及其同源蛋白催化C−O苯酚偶聯反應的機制，研究團隊開展了晶體學研究并解析了DmlH和DmlH−7復合物的晶體結構，首次揭開了分子內C−O苯酚偶聯P450酶與大環肽結合模式的神秘面紗。同時，單環底物7的柔性結構使其NMR信號裂分復雜，難以解析結構，而DmlH−7的結構獲取提供了通過復合物晶體鑒定小分子結構的經典案例。值得注意的是，底物7與DmlH的輔因子血紅素（heme）平面之間有一個水分子，可能在苯酚偶聯反應的攫氫過程中起關鍵作用。為驗證這一推測，研究團隊開展了分子動力學（MD）模擬和量子力學/分子力學（QM/MM）計算，揭示了DmlH催化分子內苯酚偶聯反應由水介導的雙自由基機制（圖2），首次提出了水分子在雙自由基苯酚偶聯反應中的重要作用。

圖2. 分子內苯酚偶聯反應由水介導的雙自由基機制

（注：“*”為羥化氨基酸，“CM”為肉桂?；鶊F）

此外，基于生信分析，從數據庫中挖掘到81個含有Cih33同源蛋白的肽類基因簇。對這些基因簇的P450酶進行系統發育分析，發現催化分子內苯酚偶聯反應的Cih33/DmlH/EpcH和糖肽類抗生素的P450酶都聚集在同一分支，表明該分支中的其他P450酶可能具有相似的功能和機制，編碼這些P450酶的基因簇有望產生新穎的雙環肽類化合物。

綜上所述，本研究證實了雙環糖肽類化合物CHM生物合成中3個P450酶的功能，并利用酶學和計算化學等方法首次揭示了DmlH催化分子內苯酚偶聯反應由水介導的雙自由基機制，為深入理解P450酶催化的分子內苯酚偶聯反應提供了新的視角，還為發現和開發更多新穎的雙環肽類化合物奠定了研究基礎，有望為抗生素研發提供更多物質基礎。

以上研究工作得到了國家重點研發計劃“合成生物學”重點專項、國家自然科學基金委重大項目、中國科學院王寬誠率先人才計劃、廣東省自然科學基金等項目資助。

相關論文信息：Chunyan Fang^†, Liping Zhang^†, Yongchao Wang^†, Weiliang Xiong, Zier Yan, Wenjun Zhang, Qingbo Zhang, Binju Wang*, Yiguang Zhu*, and Changsheng Zhang*. Discovery and Biosynthesis of Cihanmycins Reveal Cytochrome P450-Catalyzed Intramolecular C−O Phenol Coupling Reactions. J. Am. Chem. Soc. 2024. DOI: 10.1021/jacs.4c02841.

文章鏈接：https://doi.org/10.1021/jacs.4c02841

通訊員/謝文燕 王沐眾 徐曉璐

責任編輯/劉秀