灣區時訊 近日，中國科學院南海海洋研究所熱帶海洋生物資源與生態重點實驗室（LMB）閆巖研究員團隊在真菌直線型四環混源萜ochraceopones的生物合成與酶反應機制研究方面取得新進展，相關成果“An Enzymatic Carbon-Carbon Bond Cleavage and Aldol Reaction Cascade Converts an Angular Scaffold into the Linear Tetracyclic Core of Ochraceopones”在線發表于Angewandte Chemie International Edition（《德國應用化學》）。助研李艷芹、碩士叢夢靜為共同第一作者，閆巖、王俊鋒與張長生研究員為共同通訊作者。

混源萜（meroterpenoids）是一類部分分子骨架來源于萜烯的天然產物，它們具有復雜多樣的化學結構及廣泛的生物學活性。這些豐富的骨架結構既可能來源于萜烯部分多樣化的重排與環化，也可能來源于其非萜烯部分如聚酮、吲哚、莽草酸等豐富的后修飾。因此其生物合成途徑中可能蘊含了大量新穎的酶促化學反應機制，深入研究這些酶學機制將為我們創建具有新型骨架結構和生物學活性的藥物先導提供基礎。真菌直線型四環混源萜ochraceopones具有優異的抗病毒和抗炎活性，然而其由常見的四元折線型結構轉化為獨特的直線型結構所涉及的化學合成和酶學反應機制卻極具挑戰性。

研究團隊早期從一株南極土壤來源真菌Aspergillus ochraceopetaliformis SCSIO 05702中分離得到了一類四環混源萜類化合物ochraceopones（化合物1-4，7）（J Nat Prod, 2016,79:59-65）。基于基因組學及生物信息學分析定位了負責該類化合物生物合成的基因簇（圖1），通過構建構巢曲霉異源表達體系，聯合體外微粒體實驗及蛋白表達，成功鑒定和表征了負責化合物ochraceopones形成的所有生物合成酶，并闡明了完整的生物合成途徑（圖2）。

圖1. 直線型四環混源萜ochraceopones的生物合成基因簇

圖2. 直線型四環混源萜ochraceopones的生物合成途徑推測

在這項研究中，研究團隊證明了ochraceopones的線性四環骨架是由同一個折線型前體即ochraceopone E（7）衍生而來。通過體外氘水標記的微粒體實驗，證實了化合物7生成16涉及的碳-碳鍵斷裂反應不是自發進行的，而是由多功能細胞色素P450-OchH催化完成。其通過將C13位羥基形成氧自由后促發C13-C14鍵斷裂，而后通過羥基化形成十元環的中間體18，之后自發形成化合物16（圖3）。

圖3. OchH的功能表征

為了驗證16作為真實底物的正確性，研究團隊將16與基因簇內其余后修飾基因在構巢曲霉中進行了生物轉化，并通過體外微粒體與蛋白的聯合反應證實了該反應過程。結果顯示，異構酶OchL通過催化分子內的羥醛反應將經過多步修飾的碳-碳鍵斷裂形成的十元環重新連接，形成了一個新的碳-碳鍵而呈現出最終的線性四環化合物3（圖4）。

圖4. 三環到線性四環骨架ochraceopones的生物轉化表征

然而，在異源表達及體外反應過程中，除了獲得一系列不能被繼續轉化的途徑副產物如化合物19、19’、21和23之外，均沒有檢測到反應的真正中間體（圖4）。但是就觀察到的實驗結果表明在目前的生物反應體系中，隨著氧化后修飾的多步積累，反應的真實底物在缺乏其后續生物轉化酶的條件下無法穩定存在。肯定的是，根據分離到的一系列副產物及對其形成機制的推測，可以確定整個反應中間過程存在的真實性。

總之，本研究鑒定并表征了合成ochraceopones的所有生物合成酶，并證明了完整的生物合成途徑。證實了ochraceopones類化合物是由OchHJGL催化的酶級聯反應將常見的角四環前體合成獨特線性四環骨架結構。其中，多功能細胞色素P450-OchH負責催化自由基形成并引發C-C鍵斷裂和隨后的C12的羥基化，然后OchJ催化C15羥基化和OchG催化C15-OH脫氫。最后，醛縮酶OchL通過催化分子內羥醛反應導致新的C-C鍵形成而構建最終的線性四環骨架。OchH和OchL的發現及其功能闡明將為尋找更多新的P450酶和醛縮酶提供途徑。然而，由于OchL底物的不穩定性，可能需要通過合成更穩定的底物衍生物來進一步研究其催化機理。

上述研究工作得到了國家重點研發計劃、海南省科技計劃三亞崖州灣科技城科技創新聯合項目、國家自然科學基金、中國科學院王寬誠率先人才計劃“盧嘉錫國際團隊項目”和海南省自然科學基金等的資助。

相關論文信息：Yanqin Li#, Mengjing Cong#, Wengui Liu, Xiufeng Zhang, Yiguang Zhu, Yongxaing Song, Wenjun Zhang, Hua Xiao, Yonghong Liu, Changsheng Zhang*, Junfeng Wang*, Yan Yan*. An Enzymatic Carbon-Carbon Bond Cleavage and Aldol Reaction

Cascade Converts an Angular Scaffold into the Linear Tetracyclic Core of Ochraceopones. Angew Chem Int Edit,2024. doi.org/10.1002/anie.202403365

文章鏈接：https://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/anie.202403365

通訊員/謝文燕 王沐眾 徐曉璐

責任編輯/劉秀